C'est à la fin du XIXe siècle que Gull puis Strübing décrivent le cas de patients présentant une hémoglobinurie intermittente accompagnée d'hémolyse intravasculaire. Marchiafava et Nazani en 1911, puis Micheli en 1931, établissent le tableau clinique classique de la maladie.
L'HPN, ou maladie de Marchiafava et Micheli, est aujourd'hui considérée comme une maladie de la cellule souche hématopoïétique de nature clonale.
Depuis le début des années 1980, les progrès de la cytométrie en flux puis, plus récemment, de la biologie moléculaire ont conduit à une réelle avancée dans la connaissance de la physiopathologie de cette maladie rare (220 cas diagnostiqués en 40 ans ; données de la Société française d'Hématologie [SFH]).
Dans cette revue nous envisagerons successivement la physiopathologie, les méthodes diagnostiques, et la thérapeutique de l'HPN en mettant l'accent sur les aspects récents, mais en soulignant aussi les (nombreux) points qui demeurent obscurs concernant la biologie et le traitement de cette maladie.
Physiopathologie :
A - Hémoglobinurie paroxystique nocturne et déficits membranaires - Historique :
1- Sensibilité anormale des cellules à l'action du complément :
Dès les premières descriptions, au début du siècle, la sensibilité anormale des globules rouges à l'action lytique du complément a été considérée comme la caractéristique princeps de la maladie. Elle est encore de nos jours à la base des tests diagnostiques de Ham et du test au sucrose.
Dans ces tests, les globules rouges atteints sont identifiés, indirectement, par leur hémolyse sélective en présence de complément activé en milieu acide ou en présence de sucrose.
Cette sensibilité anormale des globules rouges à l'action du complément a très vite fait évoquer un déficit membranaire impliquant un système de régulation de la cascade d'activation du complément.
2- Défaut de molécules régulatrices de l'action du complément :
Les deux voies d'activation du complément (classique et alterne) se rejoignent en une voie effectrice commune conduisant à la formation d'un complexe multimoléculaire appelé complexe lytique ou complexe d'attaque membranaire.
L'étape centrale d'activation est la formation de fragments activés de la fraction C3 (C3b) par les C3 convertases des deux voies d'activations.
Au début des années 1980, plusieurs équipes ont démontré que deux protéines, dont le rôle est d'inhiber l'action du complément, n'étaient pas exprimées à la surface des globules rouges de patients atteints d'HPN.
Ces deux molécules sont le DAF (decay accelerating factor) ou CD55, qui agit au niveau des C3 convertases, et le MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis) ou CD59, qui agit en inhibant la formation du complexe d'attaque membranaire.
3- Défaut du système d'ancrage :
A la suite de ces travaux montrant le défaut d'expression du CD55 et du CD59, d'autres déficits moléculaires ont été identifiés sur les cellules de patients atteints d'HPN.
Comment alors expliquer le fait que des molécules dont les fonctions sont apparemment aussi éloignées que, par exemple, le DAF et la molécule d'adhésion LFA3 (CD58) soient manquantes dans l'HPN ?
La réponse à cette question a été apportée par la découverte que toutes ces molécules ont un élément structurel commun : elles sont attachées à la membrane par une ancre glycosyl-phosphatidylinositol (GPI).
B - Aspects biochimiques et moléculaires :
1- Structure du système d'ancrage GPI :
Au cours de l'HPN, l'absence d'expression à la surface des cellules sanguines de certaines protéines n'est pas liée à un défaut de synthèse (celle-ci est normale), mais à l'absence de système d'ancrage GPI.
Cette ancre confère à la protéine des caractéristiques biochimiques (clivage par des phospholipases spécifiques) et des propriétés physiologiques particulières (grande mobilité latérale).
Le système GPI n'est pas une structure transmembranaire. Extrêmement bien conservée dans le règne animal, elle consiste en un phosphatidylinositol (PI) dont les acides gras pénètrent dans le feuillet lipidique externe de la membrane.
La partie inositol est liée à une molécule de glucosamine (GlcN), puis à trois molécules de mannose dont la troisième porte un éthanolamine phosphate.
Le groupement amine primaire de l'éthanolamine est engagé dans une liaison peptidique avec la partie C-terminale de la protéine ancrée.
2- Biosynthèse de l'ancre GPI :
L'assemblage biochimique de l'ancre GPI dans les réticulums endoplasmiques a été démembré grâce à trois système expérimentaux :
- la biosynthèse de l'acétyl-cholinestérase érythrocytaire ;
- celle d'une protéine du trypanosome (VSG) ;
- et l'étude de lignées de lymphome murin déficientes pour l'expression d'une molécule GPI (l'antigène Thy-1).
Ces dernières ont été d'un apport essentiel à la compréhension de la voie de biosynthèse de l'ancre GPI.
En effet, grâce à la technique de fusion cellulaire et d'hybridation somatique, neuf classes de complémentation ont été identifiées et caractérisées (notées de A à I) correspondant donc à neuf gènes putatifs qui interviendraient dans la synthèse de l'ancre GPI.
Trois classes de complémentation (A, C, et H) ont pour résultat l'incapacité à synthétiser le premier métabolite (N-acétyl-glucosaminyl-phosphatidylinositol, NacGlc-PI).
Cette étape nécessite donc le produit d'au moins trois gènes.
3- Clonage du gène PIG-A :
Récemment, une étape fondamentale dans la compréhension de la maladie a été franchie grâce à l'établissement de lignées lymphoblastoïdes issues de patients atteints d'HPN.
L'étude de ces lignées lymphoblastoïdes a permis de montrer que dans l'HPN, le déficit GPI était dû à l'atteinte des premières étapes de la voie de biosynthèse (NacGlc-PI).
La synthèse du NacGlc-PI est, selon la classification en groupes de complémentation, susceptible de faire intervenir trois gènes, baptisés PIG-A, PIG-C et PIG-H.
L'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) de deux de ces gènes a récemment été cloné et séquencé (PIG-A et PIG-H).
Le groupe de Kinoshita a démontré que la transfection de l'ADNc de PIG-A dans des lignées lymphoblastoïdes issues de patients atteints d'HPN, restaurait le déficit en GPI.
Il a mis en évidence les anomalies moléculaires de l'acide ribonucléique messager (ARNm) et du gène PIG-A dans ces lignées mais, aussi et surtout, démontré existence des mêmes anomalies moléculaires dans les granuleux des mêmes patients.
Des conclusions analogues sont issues de travaux contemporains du groupe de Luzzatto.
Alors que trois gènes, dont deux sont connus, sont responsables de la synthèse du NacGlc-PI, pourquoi un seul, à ce jour, est-il responsable de l'HPN ?
L'explication est la suivante : le gène PIG-A est situé sur le chromosome X (en Xp22.1) alors que PIG-H est situé sur un autosome (en 14q11-24).
La localisation du gène PIG-A sur le chromosome X rend parfaitement compte de l'expression phénotypique d'une mutation récessive puisque, tant chez la femme (par inactivation somatique aléatoire d'un des chromosomes X) que chez l'homme, un seul allèle est exprimé. Enfin, la structure génomique de PIG-A, et de son homologue murin Pig-a, a été déterminée.
Le gène PIG-A comporte six exons répartis sur 17 kb.
4- PIG-A et HPN : étude moléculaire :
Ces découvertes fondamentales ont ouvert la voie du diagnostic moléculaire de l'HPN.
En utilisant des techniques d'étude de l'ARNm (RT-PCR) ou de l'ADN génomique (PCR-SSCP) suivies du séquençage du produit d'amplification, plusieurs équipes ont démontré que des altérations moléculaires du gène PIG-A sont retrouvées chez tous les patients atteints d'HPN à ce jour (environ un centaine de patients étudiés).
Il s'agit dans presque tous les cas de mutations ponctuelles (délétion, insertion ou substitution d'une ou deux base (s).
Une majorité de ces mutations génère un décalage du cadre de lecture dont le produit de traduction est, a priori, une molécule tronquée inactive. Les variations phénotypiques (absence totale de molécules GPI ou expression diminuée mais non nulle, sont liées à la nature de l'anomalie génétique, une expression faible des molécules GPI pouvant être liée à un faible niveau de transcription, à une instabilité du transcrit ou à l'expression d'une protéine anormale présentant une activité résiduelle.
Point important : les mutations décelées à ce jour, se situent sur l'ensemble du gène, dans les régions codantes comme dans les introns, l'anomalie s'exprimant dans ce dernier cas par un défaut d'épissage.
Il n'existe donc pas de point chaud de mutation dans PIG-A. Ainsi, malgré le fait que de telles études sont indispensables pour l'extension de nos connaissances sur le plan fondamental, il semble illusoire à ce jour de croire au développement d'un diagnostic moléculaire en pratique clinique pour l'HPN.
Enfin, signalons le fait qu'un certain nombre de malades semblent être porteurs de plusieurs anomalies génétiques de PIG-A.
Ces différentes mutations affectent généralement des populations cellulaires différentes.
Ces observations ont été interprétées comme un argument en faveur de la nature oligoclonale de certaines HPN (le gène PIG-A étant alors considéré comme un gène hypermutable appartenant à la famille des gènes dits « de ménage »).
5- Biologie cellulaire de l'HPN :
Alors que les travaux de biologie moléculaire ont permis de reconnaître et d'analyser le gène responsable de l'HPN, l'approche cellulaire (à la lumière des avancées moléculaires récentes) devrait permettre d'envisager la physiopathologie de l'HPN sous un nouvel angle. On sait depuis le début des années 1980 que les progéniteurs médullaires, comme les cellules du sang périphérique, sont hétérogènes vis-à-vis du phénotype HPN.
En effet, l'HPN est caractérisée par la coexistence, chez la majorité des patients, de cellules normales et de cellules mutées (« le clone » HPN).
L'importance relative du « clone » HPN et de l'hématopoïèse normale est variable d'un patient à l'autre (et même chez le patient lui-même durant l'évolution de sa maladie).
Les premiers travaux avaient déjà montré l'hétérogénéité des précurseurs myéloïdes (CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-E, BFU-E, CFU-meg) vis-à-vis de l'action lytique du complément. Des travaux ultérieurs ont démontré que cette hétérogénéité était bien liée à la coexistence de populations GPI positive (normale) et négative (mutée).
Des travaux récents montrent que la population des cellules souches médullaires (CD34+) expriment les molécules GPI suivantes : CD55, CD59, et Thy-1 (Cdw90).
Chez un nombre limité de patients présentant une HPN, il a été démontré l'existence aux niveaux médullaire et sanguin de populations CD34+/CD59+ et CD34+/CD59-.
L'ensemble de ces travaux a conduit Rotoli et Luzzatto à proposer un modèle dans lequel la population médullaire GPI- (issue d'une ou quelques cellules souches) possède un avantage de croissance (ou de survie) intrinsèque face à un mécanisme d'agression responsable d'une aplasie médullaire.
Ce modèle séduisant mérite cependant d'être révisé à la lumière de travaux récents.
En effet :
- l'altération du gène Pig-a murin par recombinaison homologue (knock out) ne conduit pas à une expansion du clone muté ou à un avantage de croissance des cellules embryonnnaires mutées (cellules ES) ;
- l'injection de cellules médullaires CD34+ de patients atteints d'HPN chez la souris immunodéficiente (SCID-humanisée) ne montre pas non plus d'avantage de croissance sélectif de la population mutée.
Les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l'HPN sont donc vraisemblablement plus complexes que supposés initialement.
Ce dernier point peut être illustré par le problème des crises hémolytiques présentées par ces patients.
Si l'absence de molécules GPI, et en particulier du CD55 et du CD59, explique la sensibilité anormale des érythrocytes au complément in vitro (test de Ham), comment expliquer les crises hémolytiques de ces patients ?
Il semble qu'à l'occasion d'une infection, par exemple, les globules rouges des patients puissent réexprimer à leur surface des antigènes cryptiques (du système Th) ; ces antigènes sont alors reconnus par le système immunitaire, qui active le complément, lequel n'est plus régulé par CD55 et CD59 ce qui aboutit à une crise hémolytique.
D'autres aspects de la physiopathologie demeurent néanmoins largement méconnus :
- quel est le mécanisme de l'hypoplasie médullaire ?
- quels sont les mécanismes impliqués dans la genèse des thromboses : libération de microvésicules à pouvoir procoagulant, déficit du récepteur au plasminogène ?
- existe-t-il un déficit immunitaire chez ces patients : lymphocytes GPI-, altération du chimiotactisme des polynucléaires GPI- ?
Autant de questions qui font l'objet de recherches actuelles.
Diagnostic :
A - Tests classiques :
Bien que de nombreux tests diagnostiques aient été décrits dans cette maladie (test de Crosby, test au sucrose), c'est le test de Ham et Dacie qui a retenu l'attention de la majorité des hématologues au cours de ces dernières années.
Il consiste à mesurer l'hémolyse des globules rouges in vitro en présence de complément. Bien qu'une estimation quantitative soit théoriquement possible (par néphélométrie), la plupart des laboratoires rendent des résultats semi-quantitatifs (+ à +++).
Le test de Ham et Dacie permet, de plus, d'isoler chez certains patients trois populations cellulaires : - des hématies de sensibilité normale au complément (dites de type I) ;
- des cellules très sensibles (dites de type III) ;
- et des cellules de sensibilité intermédiaire (dites de type II).
Cependant ce test, utilisé comme critère diagnostique depuis de nombreuse années, tend aujourd'hui à être supplanté par l'étude des molécules GPI en cytométrie de flux.
B - Diagnostic immunocytologique :
Bien que les molécules liées au GPI puissent être étudiées dans des extraits cellulaires par méthodes radio-immunologique ou par Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay), l'outil actuel le plus performant est l'étude immunocytologique par cytométrie en flux.
Après un nombre important de travaux de recherche clinique il est maintenant clair que cette technique offre de multiples avantages.
Elle permet l'analyse rapide des différentes populations leucocytaires et lymphocytaires à partir du sang total (ou éventuellement après séparation cellulaire dans certains protocoles expérimentaux).
Comme pour le test de Ham elle permet de distinguer les trois populations cellulaires (HPN de type I, II, ou III).
Les résultats obtenus peuvent être exprimés :
- en pourcentage de cellules négatives (importance relative du clone dans la population étudiée) ;
- et/ou en moyenne d'intensité de fluorescence (unités arbitraires en échelle logarithmique).
Cette dernière manière d'exprimer les résultats est utile, d'une part pour l'étude de certaines molécules comme le CD16 ou le CD58 dont l'expression physiologique est faible, d'autre part dans la mise en évidence de populations dites « intermédiaires » ou PNH II (populations cellulaires exprimant à leur surface un niveau faible, mais non nul d'une molécule GPI donnée).
La sensibilité de la cytométrie en flux dans le diagnostic d'un déficit des molécules GPI permet de détecter des clones dont l'importance n'excède pas quelques pourcent.
En pratique, pour la majorité des molécules étudiées, un déficit peut être considéré comme significatif lorsque le pourcentage de cellules négatives est supérieur à 5 %.
Quelle est donc la place de la cytométrie par rapport aux tests classiques de Ham-Dacie et du sucrose ?
L'ensemble des auteurs s'accorde pour dire que la cytométrie de flux est une méthode plus sensible et spécifique que les tests classiques.
D'autre part, si dans le diagnostic des formes de novo les résultats des tests classiques sont, dans l'immense majorité des cas, tout à fait concordants avec ceux de la cytométrie en flux, le diagnostic des HPN survenant après aplasie médullaire pose le problème d'une autre manière.
En effet, notre expérience, ainsi que celle d'autres auteurs, confirme l'existence chez ces derniers patients d'un « syndrome de déficit des molécules GPI ».
Ce « syndrome de déficit des molécules GPI » est caractérisé par l'existence du déficit sur une ou plusieurs lignées.
Il débute souvent par une atteinte isolée de la lignée granulocytaire et/ou monocytaire et peut, au moins initialement, épargner les globules rouges (les tests classiques de Ham-Dacie et sucrose sont alors négatifs, mais des réticulocytes GPI- peuvent-ils être mis en évidence ?
Ce problème, sémantique avant tout, de définition du « syndrome de déficit des molécules GPI » par rapport aux HPN n'est pas résolu.
Enfin, qu'en est-il de la spécificité de la cytométrie en flux ou, en d'autres termes, existe-t-il d'autres maladies hématologiques clonales, ou non clonales, dans lesquelles on mettrait en évidence un syndrome de déficit des molécules GPI ? à notre connaissance, à l'exception de deux maladies rarissimes (défauts congénitaux du DAF et du MIRL) le syndrome de déficit des molécules GPI n'a été décrit que dans les HPN (HPN de novo ou HPN survenant après aplasie médullaire).
Il est donc vraisemblable que, dans les années à venir, la cytométrie en flux remplacera le test classique de Ham. Soulignons cependant la nécessité absolue (liée à des contraintes techniques, et de rares problèmes particuliers) :
- d'utiliser au moins deux anticorps reconnaissant deux molécules GPI différentes ; - et d'étudier deux populations cellulaires différentes qui, à notre avis, doivent être les réticulocytes et les polynucléaires.
Aspects cliniques :
La forme la plus classique, sinon la plus courante, de la maladie est celle d'une anémie hémolytique acquise d'origine corpusculaire, apparaissant chez un adulte jeune, accompagnée d'urines foncées le matin et parfois d'un ictère modéré.
L'anémie est accompagnée de signes de régénération modérés (réticulocytose) et souvent d'une leucopénie et/ou d'une thrombopénie généralement non sévère.
En pratique courante, l'HPN est diagnostiquée dans deux circonstances : celle d'une maladie hémolytique et thrombosante classique que l'on peut appeler l'HPN « primitive » ou « de novo » ou celle de la découverte d'un clone HPN chez un patient atteint d'aplasie médullaire traité, quelques mois ou années auparavant, par immunosuppression.
Enfin, plus rarement, le diagnostic d'HPN a été associé à un certain nombre d'hémopathies malignes myéloïdes.
En fait, ces présentations sont schématiques et le polymorphisme clinique de cette maladie est important.
Au diagnostic, dans la série de la SFH, si la moyenne d'âge au moment du diagnostic était bien de 33 ans, près de 15 % des patients étaient des enfants (moins de 16 ans).
Un tiers des patients seulement avaient une anémie isolée et un autre tiers des patients se présentaient initialement avec une pancytopénie, généralement modérée. Le myélogramme montre fréquemment dans ce dernier cas une moelle non désertique.
L'HPN fait donc partie des diagnostics à évoquer devant une pancytopénie à moelle « riche ».
Près d'un tiers des patients ayant une HPN ont, dans notre expérience, un diagnostic préalable d'aplasie médullaire et, élément supplémentaire de réflexion, la mise en évidence d'une HPN après traitement immunosupresseur des aplasies médullaires est de l'ordre de 20 à 30 %.
La médiane de survie des patients est de 10 à 15 ans.
Le problème majeur qui vient grever l'évolution des patients atteints d'HPN est représenté par les thromboses (qui peuvent être inaugurales).
L'incidence actuarielle des thromboses dans la série de la SFH est de 25 % à 5 ans.
Les deux localisations les plus fréquentes de ces thromboses sont les veines sus-hépatique (syndrome de Budd-Chiari) et le système nerveux central.
Deux autres complications sont aussi fréquemment rencontrées (chacune chez 20 % des malades) : des crises douloureuses abdominales (d'étiologie incertaine : microthromboses mésentériques) et des infections récurrentes de la sphère ORL et pulmonaires, en particulier.
Chez les patients atteints d'HPN de novo la probabilité de développer une pancytopénie durant l'évolution est estimée à 15 % à 8 ans.
Le risque de développement d'un syndrome myélodysplasique ou une leucémie aiguë est classique mais rare (5 et 1 % à 8 ans, respectivement).
Dans l'étude de la SFH, une étude multifactorielle des facteurs de risque de décès a pu être réalisée pour la première fois dans cette maladie rare.
Les facteurs affectant de manière indépendante la survie de ces patients sont :
- le développement d'une thrombose ;
- la progression d'une HPN de novo vers un tableau de pancytopénie ;
- le développement d'un syndrome myélodysplasique ou une leucémie aiguë ;
- l'âge (plus de 54 ans) ; - et une thrombopénie au diagnostic. Dans cette étude, les patients ayant une aplasie médullaire préexistante semblent avoir un meilleur pronostic.
Traitement :
La rareté de cette maladie a conduit à l'emploi de thérapeutiques variées dont l'intérêt potentiel est difficilement évaluable.
Cependant, on peut essayer de dégager les grandes lignes suivantes.
Les transfusions de concentrés globulaires demeurent indispensables en cas d'anémie importante et/ou mal tolérée mais le dogme de transfuser des culots globulaires décomplémentés a récemment été remis en question.
La greffe de moelle osseuse allogénique reste la seule thérapeutique curative, mais elle est grevée d'une lourde mortalité liée à la procédure chez des patients souvent multitraités depuis de nombreuses années.
Une survie d'environ 50 % à long terme après greffe a été rapportée. Enfin un certains nombre de médicaments sont potentiellement utiles dans cette maladie :
- les immunosuppresseurs (ciclosporine et sérum antilymphocytaire) ont été employés avec succès dans certaines formes très pancytopéniques ;
- les androgènes semblent avoir une certaine efficacité de même que le danazol et les corticoïdes.
L'utilisation d'antiagrégants plaquettaires ou d'anticoagulants est prônée en cas d'antécédent de thrombose.
