Composants cellulaires du tissu de soutien médullaire :
A - Origine :
Les cellules stromales et les cellules hématopoïétiques dérivent du mésenchyme primitif embryonnaire mais les deux lignées divergent ensuite.
L'analyse du génotype des fibroblastes médullaires de patients receveurs de greffe de moelle allogénique a montré qu'il était toujours identique à celui du receveur, contrairement aux lignées lymphoïdes et myéloïdes qui proviennent du donneur.
Même s'il n'existe chez l'homme adulte aucun argument expérimental convaincant en faveur d'une cellule souche commune aux lignées stromales et hématopoïétiques, on ne peut toutefois exclure qu'au cours de l'ontogenèse certains progéniteurs puissent exprimer une double potentialité, comme cela a été prouvé chez les oiseaux. Si l'hématopoïèse à l'âge adulte est confinée au tissu médullaire, il n'en est pas de même au cours du développement.
Les premiers îlots hématopoïétiques apparaissent dans la vésicule vitelline extraembryonnaire, puis le relais est pris par le foie aux alentours de la 6e semaine avant que la moelle ne soit colonisée vers la 15e semaine de développement.
On ignore presque tout du phénotype des cellules stromales de la vésicule vitelline, du foie foetal et de la moelle osseuse embryonnaire.
On ignore aussi leur fonction et leur responsabilité dans l'expression des propriétés uniques des cellules souches hématopoïétiques embryonnaires que sont leur capacité de prolifération importante et la restriction de la différenciation terminale à la seule lignée érythroïde.
Une étude récente chez la souris suggère que les cellules du mésoderme et de l'endoderme vitellin stimuleraient la prolifération de cellules hématopoïétiques adultes plus efficacement que les cellules stromales médullaires adultes.
B - Composants du microenvironnement médullaire :
A l'âge adulte et en situation d'équilibre, le tissu médullaire assure seul la production des cellules hématopoïétiques.
Le tissu de soutien médullaire est composé de fibroblastes, de cellules endothéliales, de cellules musculaires lisses, d'adipocytes, ces derniers résultant en partie de l'accumulation de lipides dans des fibroblastes.
Il faut ajouter à cette liste les constituants du tissu osseux, et notamment les ostéoblastes, qui ont probablement une fonction importante dans la régulation de l'hématopoïèse.
La cohésion du tissu médullaire est assurée par l'entrelacement fibrillaire des protéines de la matrice extracellulaire sécrétées par les cellules stromales et constituant le tissu conjonctif.
Beaucoup d'incertitudes subsistent sur le phénotype, la répartition dans le tissu médullaire et la fonction des cellules stromales.
On ne sait pas en particulier s'il existe dans la moelle des sous-populations stromales spécialisées ou si toutes les cellules stromales ont la même compétence intrinsèque, compétence (notamment synthèse de cytokines) qui peut être modulée localement.
Ces incertitudes s'expliquent en partie par la rareté des études histologiques chez l'homme, mais également par les limitations inhérentes aux techniques de culture in vitro.
Hormis les fibroblastes, il est en effet difficile de purifier et cultiver in vitro les autres cellules stromales comme les cellules endothéliales médullaires et les ostéoblastes et d'étudier individuellement leur fonction.
En outre, contrairement à la multiplicité des lignées stromales permanentes dérivées spontanément de cellules médullaires murines, chez l'homme, l'immortalisation de cellules stromales nécessite le recours à une transformation généralement par l'intermédiaire d'un virus transformant.
Aucun modèle expérimental cependant ne reproduit in vitro la complexité de l'organisation du tissu médullaire in vivo.
En utilisant des critères morphologiques, Dexter distinguait trois types de cellules stromales dans des cultures de moelle murine.
Il est cependant très difficile d'assigner les cellules stromales à un phénotype précis : ceci s'explique en partie par la modulation très rapide des propriétés de ces cellules en culture et par l'absence de marqueurs spécifiques. Ainsi, toutes les cellules stromales synthétisent les protéines de la matrice extracellulaire
- fibronectine, thrombospondine, vitronectine, collagènes, et protéoglycanes
- mais peu d'associations sont spécifiques d'un type cellulaire. Toutes les cellules stromales expriment l'antigène CD34 mais son expression est perdue très rapidement en culture.
L'origine endothéliale d'une cellule stromale est affirmée sur l'expression de marqueurs spécifiques : l'expression du facteur von Willebrand intracellulaire et matriciel, l'existence des corps de Weibel-Palade, l'expression de la lectine Ulex Europeaus, ou encore la synthèse de collagène IV et de laminine, deux composants de la membrane basale.
Cependant, toutes les cellules endothéliales n'expriment pas le facteur von Willebrand, et en culture certains fibroblastes synthétisent du collagène IV et de la laminine, ce qui souligne la difficulté d'un phénotypage rigoureux.
Le problème est compliqué par l'hétérogénéité des cellules endothéliales : non seulement les cellules endothéliales de type capillaire (comme dans la moelle) ont des propriétés très différentes des cellules endothéliales bordant les vaisseaux de gros calibre, mais elles expriment une spécificité tissulaire : ainsi les cellules de la barrière méningée expriment un phénotype différent de celui des cellules postcapillaires du ganglion.
Il est intéressant de rappeler que dans l'îlot hématopoïétique, les cellules hématopoïétiques ne sont pas directement en contact avec la circulation et que toutes les molécules nécessaires au métabolisme cellulaire doivent franchir la barrière étanche constituée par les cellules endothéliales.
Il n'existe pas de marqueur spécifique de fibroblaste, et on classe dans cette catégorie toute cellule de forme allongée, n'exprimant aucun marqueur endothélial ou épithélial, et synthétisant des protéines de la matrice extracellulaire, fibronectine et collagènes de types I, III et VI.
On ne connaît pas vraiment l'origine des fibroblastes médullaires présents dans un échantillon de moelle osseuse : paroi des artérioles, compartiment osseux, ou tissu conjonctif lui-même. Leur probable hétérogénéité sera peut-être décryptée grâce à l'utilisation d'un panel plus large de marqueurs immunologiques. Une spécificité tissulaire des fibroblastes est suggérée par deux observations :
- l'expression constitutive par les fibroblastes médullaires de la molécule d'adhésion VCAM (« vascular cell adhesion molecule ») qui n'est pas synthétisée par les fibroblastes de peau non activés ;
- une spécificité fonctionnelle, puisque seules les lignées de fibroblastes médullaires transformées par SV-40 stimulent l'hématopoïèse, propriété que n'expriment pas les lignées de fibroblastes extramédullaires.
Importance du tissu de soutien dans la régulation de la prolifération et de la différenciation hématopoïétiques :
Dans les années 1970, l'hypothèse d'un rôle décisif du microenvironnement sur la détermination des cellules souches avait été suggérée (théorie « inductive »), mais il semble plus probable que l'engagement d'une cellule souche vers une lignée de différenciation soit un processus « stochastique », ce qui n'exclut pas qu'il puisse être modulé par des interactions étroites avec les composants du tissu de soutien.
Les premiers arguments expérimentaux suggérant l'importance du stroma dans la régulation de l'hématopoïèse sont d'ordre chronologique : ainsi, la reconstitution du tissu de soutien médullaire précède toujours la reconstitution hématopoïétique après irradiation ou déplétion mécanique du tissu médullaire.
In vivo, l'implantation dans la cavité péritonéale de souris de membranes d'ester de cellulose recouvertes de cellules stromales ou la greffe sous-cutanée d'extraits de matrice osseuse entraînent la reconstitution dans ces structures d'un microenvironnement organisé capable de permettre secondairement la colonisation et le développement d'une hématopoïèse active dans un délai de quelques semaines à quelques mois.
De même que l'étude des hémopathies humaines a facilité l'identification des étapes de la différenciation hématopoïétique normale, de même l'analyse des dysfonctionnements du stroma médullaire a contribué à notre connaissance des mécanismes de son action.
L'exemple le plus connu est celui des souris steel.
On savait depuis longtemps grâce à des expériences de transplantation croisée que les anomalies hématologiques de ces souris étaient dues à un dysfonctionnement du stroma médullaire, mais l'identification du mécanisme moléculaire ne date que de 1990.
Ces souris sont porteuses d'une mutation ou délétion, au niveau du chromosome 10 (locus steel), dans la séquence codante du gène codant pour un facteur de croissance essentiel à la prolifération et à la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques, le facteur steel ou « stem cell factor » ou ligand de c-kit (le récepteur de ce facteur est le produit du proto-oncogène c-kit).
La molécule steel est synthétisée exclusivement par les cellules stromales et son absence entraîne une aplasie médullaire.
L'équivalent humain de cette pathologie n'a pas été décrit. Dans ce cas, il n'y a aucune anomalie ni morphologique, ni quantitative du compartiment des cellules stromales in vitro ou in vivo, ce qui souligne l'importance des tests fonctionnels dans l'identification du dysfonctionnement.
Un dysfonctionnement du stroma peut aussi être expliqué par son immaturité, ce que suggèrent les expériences de Zanjani chez le mouton.
Ainsi, lorsque des cellules hématopoïétiques médullaires sont transplantées in utero dans la cavité péritonéale d'un foetus de mouton, elles migrent dans la moelle et s'y maintiennent, mais n'y prolifèrent pas.
L'hypothèse avancée est qu'avant la date de colonisation normale de la moelle par les cellules souches, le microenvironnement de la moelle est incapable d'assurer une différenciation complète des cellules souches hématopoïétiques.
In vitro, l'analyse du phénotype et de la fonction des cellules stromales s'est faite dans le système dit de culture de moelle à long terme, décrit initialement par Dexter chez la souris puis adapté à l'homme.
Ce modèle reproduit l'organisation du tissu médullaire in vivo et permet d'obtenir une hématopoïèse active et prolongée pendant plusieurs semaines.
Ces cultures à long terme sont établies en incubant dans un flacon de culture un échantillon de moelle, obtenu par aspiration ou curetage osseux, contenant cellules stromales et hématopoïétiques, dans un milieu de culture riche en sérum et contenant de l'hydrocortisone.
Les cellules stromales de l'échantillon adhèrent au fond du flacon et y prolifèrent, reconstituant l'équivalent du microenvironnement in vivo.
On y trouve en proportion variable des fibroblastes (phénotype prédominant), des cellules endothéliales (généralement moins de 20 %), des cellules musculaires lisses, des cellules osseuses et des macrophages (assimilés fonctionnellement au tissu de soutien).
Les cellules hématopoïétiques les plus immatures (proches des cellules souches) se nichent dans cette fraction adhérente, y prolifèrent et s'y différencient, et relarguent dans la fraction non adhérente les progéniteurs plus matures et les cellules différenciées de la lignée granuleuse (l'érythropoïétine n'étant pas synthétisée dans la moelle, l'obtention d'une différenciation érythroïde terminale requiert l'addition d'érythropoïétine exogène).
Dans ce système où aucune cytokine exogène n'est ajoutée, le développement de l'hématopoïèse requiert la présence d'un stroma fonctionnel, synthétisant des molécules régulatrices positives et négatives.
Cette propriété qu'ont les cellules stromales de permettre le développement de l'hématopoïèse in vitro a été adaptée depuis à l'identification et à la quantification de progéniteurs hématopoïétiques très immatures.
Ces progéniteurs ne représentent qu'une fraction infime (moins de 0,05 %) des cellules médullaires et ne sont pas reconnaissables par les critères habituels d'identification des progéniteurs hématopoïétiques plus matures (phénotype immunologique, capacité à former des colonies).
Par contre, lorsque ces progéniteurs primitifs sont incubés en présence de cellules stromales pendant 4 à 6 semaines, ils prolifèrent et produisent des progéniteurs plus matures facilement identifiables.
L'identification de ces cellules souches se fait donc indirectement par la quantification de leur descendance et la présence de cellules stromales est indispensable à ce processus.
Malgré son importance pour l'identification de progéniteurs primitifs humains proches des cellules souches hématopoïétiques humaines, il y a plusieurs limites à ce système de culture in vitro :
- l'hématopoïèse active ne s'y maintient que quelques semaines, probablement par épuisement des propriétés du stroma et aucun système in vitro ne reproduit les performances de la moelle in vivo ;
- il est exceptionnel d'obtenir dans ces cocultures une différenciation myéloïde et lymphoïde B simultanément, or ce critère est indispensable à la définition d'une cellule souche.
Mécanismes moléculaires de la régulation de la prolifération et de la différenciation hématopoïétique par les cellules stromales :
A - Facteurs de croissance :
Jusqu'à ce jour plus d'une vingtaine de cytokines impliquées dans la régulation positive ou négative de l'hématopoïèse ont été identifiées et leurs gènes clonés. A l'exception de trois cytokines dont la production est extramédullaire, l'érythropoïétine (cellules péritubulaires du rein), l'interleukine-(IL-)-3 (lymophocytes T activés) et probablement le ligand de mpl, facteur plaquettaire récemment cloné, produit dans le foie et le rein, presque tous les autres facteurs de croissance connus agissant au cours de la différenciation hématopoïétique myéloïde peuvent être synthétisés par les cellules stromales médullaires.
Cependant, l'expression constitutive de ces cytokines par les cellules stromales est très discrète, comme le montre la faible quantité d'ARN messager détectée par Northern blot ou amplification enzymatique (PCR « polymerase chain reaction ») dans les cellules adhérentes des cultures de moelle à long terme, ou de protéine active identifiée par dosage biologique dans le surnageant de ces cultures.
Seuls l'IL-6, le ligand de c-kit et le M-CSF (« macrophage colony-stimulating factor ») sont détectés sans ambiguïté dans les cellules stromales non activées et il en est probablement de même pour l'IL-11 et le ligand de Flt3 récemment décrit.
La synthèse de certaines de ces cytokines, IL-6, ligand de c-kit et M-CSF, ainsi que celle du GM-CSF (« granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ») et du G-CSF (« granulocyte colony-stimulating factor ») est inductible dans les cellules stromales par l'IL-1 et le TNF- (« tumor necrosis factor »).
Le mécanisme en est soit transcriptionnel, soit post-transcriptionnel, notamment par augmentation de la stabilité de l'ARN messager. On ne connaît pas l'importance in vivo de cette induction de cytokines, qui pourrait représenter un moyen de régulation très sensible de l'hématopoïèse.
Une seconde caractéristique des cytokines synthétisées par les cellules stromales est la multiplicité de leurs formes moléculaires, les cytokines pouvant exister soit sous forme soluble, générée le plus souvent par clivage protéolytique d'un précurseur ancré dans la membrane, soit sous forme purement transmembranaire.
Le gène est unique et transcrit un ARN primitif qui subit un épissage alternatif et produit plusieurs ARN messagers matures.
Des formes solubles et transmembranaires de M-CSF, d'IL-1, de ligand de c-kit, de TNF-α et plus récemment de G-CSF ont ainsi été décrites, et ces formes transmembranaires sont biologiquement actives.
Il est probable que, pour un même effet biologique, un très faible nombre de molécules transmembranaires soit suffisant pour transduire le message, alors qu'une concentration plus importante de molécules solubles est requise en raison de leur dilution dans le tissu environnant. Ceci explique probablement qu'à l'état d'équilibre la synthèse active de ces molécules est indétectable.
Les cytokines du microenvironnement peuvent aussi être concentrées par leur adsorption sur les protéines de la matrice extracellulaire et notamment les protéoglycanes.
C'est le cas pour le FGF (« fibroblast growth factor »), le TGF-β (« transforming-growth factor »), le GM-CSF, l'IL-3, le M-CSF.
Les protéoglycanes, composés d'un squelette protéique sur lequel se fixent des chaînes de polysaccharides sulfatés, ou glycosaminoglycanes comme l'héparane sulfate ou le chondroïtine sulfate, sont synthétisés par les cellules médullaires et ont un rôle majeur dans la régulation de l'action des cytokines, schématiquement par quatre mécanismes :
- certaines cytokines, le M-CSF par exemple, forment elles-mêmes la structure protéique sur laquelle se fixe l'héparane sulfate ;
- certains protéoglycanes font partie intégrante de récepteurs de cytokines (FGF par exemple) ;
- d'autres jouent un rôle dans la présentation des cytokines ; par exemple, les protéoglycanes à héparane sulfate présents à la surface des cellules endothéliales peuvent immobiliser les cytokines circulantes comme MIP-1α (« macrophage inhibitory protein ») et faciliter ainsi leur action locale ;
- enfin, les protéoglycanes présents dans la matrice extracellulaire peuvent séquestrer des cytokines solubles, jouant ainsi un rôle de réservoir.
Il est donc probable que l'essentiel de la régulation par les cytokines dans l'îlot hématopoïétique mette en jeu des molécules associées soit à la cellule, soit à la matrice extracellulaire, mais que les formes solubles aient un rôle mineur. On ne sait absolument pas toutefois si physiologiquement in vivo toutes les cellules stromales ont le même potentiel de sécrétion de cytokines ou si la régulation de l'hématopoïèse fait intervenir des cellules stromales spécialisées.
En conclusion de ce chapitre il faut souligner plusieurs points :
- en 1994 deux nouvelles cytokines ont été identifiées, le ligand de Flt-3 et celui de c-Mpl, et d'autres cytokines d'origine stromale seront certainement identifiées dans les années à venir, en particulier les molécules régulant la différenciation lymphoïde B et les cellules souches primitives ;
- il ne faut pas sous-estimer le rôle dans l'hématopoïèse de facteurs de croissance dont le tropisme initial est extrahématopoïétique, comme le FGF, le PDGF (« platelet derived growth factor ») ou encore le NGF (« nerve growth factor »).
B - Molécules d'adhérence :
Dans le système hématopoïétique, l'adhérence des progéniteurs hématopoïétiques aux structures environnantes, matrice extracellulaire et cellules stromales intervient au cours de deux processus essentiels : les phénomènes de migration vers (« homing ») et hors de la moelle à travers la barrière endothéliale, et les interactions avec les cellules stromales et leur matrice extracellulaire dans l'îlot hématopoïétique.
Au cours des dernières années, l'identification des molécules responsables des processus d'adhérence a progressé très rapidement et plusieurs familles regroupant quelques dizaines de molécules chacune ont été caractérisées.
Il est important de souligner :
- que les mêmes molécules régulent l'adhérence et la migration leucocytaire et lymphocytaire au cours de l'inflammation et de la réponse immune ;
- que les processus d'adhérence sont plus qu'un phénomène passif et prennent une part active dans l'induction de la prolifération et de la différenciation cellulaire.
On distingue schématiquement plusieurs familles de molécules.
La famille des intégrines est composée d'hétérodimères α β dont certaines partagent la même chaîne β.
On trouve dans ce groupe la plupart des récepteurs des protéines adhésives de la matrice extracellulaire. Deux autres familles sont responsables des interactions cellule-cellule.
Les sélectines sont présentes sur les cellules stromales (E-sélectine, ou ELAM [« endothelial leucocyte cell adhesion molecule » CD62E] et P-sélectine, ou GMP-140 ou PADGEM [CD62P]) ou sur les cellules hématopoïétiques, (L-sélectine [CD62L]).
Beaucoup d'arguments expérimentaux soulignent le rôle de ces molécules dans les processus de « homing » des lymphocytes et une isoforme de l'antigène CD34 est un ligand de la L-sélectine.
La dernière famille, qui regroupe des molécules comme VCAM (CD106), ICAM (« intercellular adhesion molecule »)-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50), ou PECAM (« platelet endothelial cell adhesion molecule », CD31) a une parenté structurale avec les immunoglobulines. Ces molécules sont exprimées soit exclusivement à la surface des cellules stromales (VCAM), soit à la fois par les cellules stromales et hématopoïétiques (ICAM).
Beaucoup de molécules d'adhérence sont exprimées à la surface des progéniteurs hématopoïétiques : intégrines de la famille β 1 encore appelées VLA (« very late antigens »), en particulier VLA-4 (α4β1, CD29/CD49d) et VLA-5 (α5β1, CD29/CD49e), LFA-1 (αLβ2, CD11a/CD18), ICAM-1, L-sélectine, PECAM. VLA-5 et VLA-4 sont fonctionnels et permettent l'adhésion des progéniteurs hématopoïétiques, surtout érythroïdes, à la fibronectine (domaines RGD [arginine-glycine-Ac aspartique] ou CS1 [connecting segment 1] respectivement) ou à la molécule VCAM (ligand de VLA-4) exprimée par les cellules stromales.
Certains résultats expérimentaux dans le système murin suggèrent que cette interaction entre VLA-4 et les cellules stromales serait une étape essentielle à la prolifération/différenciation dans les cultures à long terme.
Chez l'homme cependant il ne semble pas qu'une adhérence prolongée entre cellules souches primitives et cellules stromales soit requise pour le maintien de l'hématopoïèse in vitro.
Le rôle fonctionnel d'autres récepteurs d'adhérence reste à démontrer : ainsi, la liaison du complexe CD11a/CD18 (LFA-1), exprimé sur les progéniteurs, à son ligand naturel ICAM-1 n'est pas démontrée, alors que cette interaction joue un rôle essentiel au stade de granuleux mature.
Une hypothèse est que la chaîne 2 ne soit pas sous forme active à ce stade précoce de la différenciation.
Contrairement aux processus de « homing » des lymphocytes, les mécanismes moléculaires régulant le trafic des cellules souches à travers la barrière endothéliale sont beaucoup moins bien connus : au cours de l'ontogenèse, on admet classiquement que les cellules hématopoïétiques migrent du sac vitellin, premier site hématopoïétique, jusqu'au foie foetal vers la 6e semaine de développement, puis colonisent la moelle à partir de la 15e semaine.
A l'âge adulte, les processus de migration des cellules hématopoïétiques interviennent à deux niveaux :
- dans l'espace médullaire lui-même où les progéniteurs ne sont pas distribués au hasard ;
- lors des phénomènes de migration à travers la barrière endothéliale : l'hématopoïèse chez l'homme est un processus extravasculaire et les cellules matures de toutes les lignées, réticulocytes, polynucléaires, monocytes, mégacaryocytes passent dans la circulation en traversant la barrière endothéliale.
Cette migration est un processus transendothélial, contrairement à la diapédèse des polynucléaires et des monocytes circulants vers le tissu interstitiel lors de l'inflammation, qui se fait quant à elle entre deux cellules endothéliales.
Si à l'état normal seules les cellules matures traversent la barrière endothéliale, on sait que les cytokines, en particulier le G-CSF et le GM-CSF, utilisées en thérapeutique stimulent le passage dans la circulation de progéniteurs immatures et probablement des cellules souches capables de reconstituer l'hématopoïèse à long terme.
L'implication des intégrines dans ces processus de migration est largement suggérée d'une part par la disparition des molécules VLA-4 et VLA-5 à la fin de la maturation érythroïde, d'autre part par l'observation que l'injection à des singes d'un anticorps anti-VLA-4 entraîne une mobilisation importante des progéniteurs dans la circulation.
Cette possibilité d'induire la mobilisation des progéniteurs par les cytokines est actuellement exploitée à des fins thérapeutiques puisque les cellules mobilisées sont collectées par cytaphérèse et utilisées en transplantation médullaire.
Un processus de migration inverse permet la colonisation de la moelle par les cellules du donneur après transplantation mais les mécanismes de la sélectivité de cette migration ne sont pas connus.
Par analogie avec la migration lymphocytaire, on peut imaginer que des groupements carbohydrates (dont la protéine CD34) et leurs récepteurs de type lectine (L-sélectine par exemple) soient impliqués.
La diversité des associations ligand-récepteur, créée en particulier par l'hétérogénéité des glycosylations d'une molécule unique (comme la molécule CD34), peut expliquer la spécificité tissulaire des processus de migration.
Conclusion :
Le réseau d'interactions moléculaires qui aboutit à une régulation harmonieuse des différentes étapes de la différenciation hématopoïétique humaine dans le tissu médullaire commence à peine à être décrypté.
De nombreuses cytokines et molécules d'adhérence, acteurs principaux de cette régulation, ont été identifiées et la fonction de chacune de ces molécules individuellement testée et définie.
Le défi de ces prochaines années sera de comprendre comment ces molécules interagissent entre elles et si des associations spécifiques permettent de réguler sélectivement le développement de sous-populations de progéniteurs hématopoïétiques.
Certains arguments expérimentaux suggèrent déjà que cytokines et molécules d'adhésion agissent en synergie, et que les cytokines régulent l'expression des molécules d'adhérence et réciproquement.
Un second défi sera de déterminer si certaines pathologies hématologiques humaines peuvent résulter d'un dysfonctionnement des interactions entre cellules souches hématopoïétiques et cellules stromales médullaires, affectant les processus d'adhérence ou la synthèse de cytokines.
