Warning: settype() expects parameter 2 to be string, array given in /home/mochb/public_html/header.php on line 88 Apport des techniques d'hybridation fluorescente in situ dans les hémopathies malignes - NewsDoc - Cours de médecine / annonces gratuites
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Apport des techniques d'hybridation fluorescente in situ dans les hémopathies malignes
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Introduction :
Depuis sa description originale (en 1969), l'hybridation in situ, a été développée de telle manière qu'aujourd'hui un très grand nombre de sondes d'ADN (acide désoxyribonucléique) de différentes origines peut être localisé à l'intérieur du génome avec une grande efficacité. Récemment, avec l'introduction des méthodes de détection fluorescente non isotopique (fluorescent in situ hybridization [FISH]), l'hybridation in situ a été transformée en une méthode rapide et sensible.
Le large choix de nucléotides marqués, associés à un grand nombre de systèmes de détection de différentes couleurs, a permis l'analyse simultanée de plusieurs sondes en FISH multicouleurs.
L'introduction de cette technique a révolutionné la cytogénétique et la pratique quotidienne de l'oncohématologie.
Généralités sur la technique de FISH :
Les techniques générales utilisées dans l'hybridation des sondes à l'ADN chromosomique, lorsqu'elles sont appliquées à des cas d'hémopathie maligne, sont identiques à celles utilisées pour d'autres tissus, étant basées sur les principes classiques d'hybridation de l'ADN, comme l'analyse de southern-blot.
La technique implique l'appariement spécifique de la sonde marquée à une séquence complémentaire, suivie d'une visualisation de cette sonde, grâce à une molécule marquée fluorescente.
La technique de FISH peut être divisée en plusieurs étapes :
- marquage ;
- hybridation au matériel pathologique ;
- détection de la sonde ;
- analyse de l'image.
A- Sondes :
Les types de sondes utilisables pour la technique de FISH sont schématiquement classables dans deux catégories principales : les sondes qui reconnaissent les répétitions spécifiques d'un locus, telle la répétition alphoïde ou celle de l'hétérochromatine, et les sondes de séquences uniques.
Cette deuxième catégorie comprend les sondes spécifiques d'un seul locus et celles recouvrant une région plus large.
Plus les séquences reconnues sont grandes, plus la probabilité qu'elles contiennent des motifs répétitifs, comme les familles Alu ou Kpn, est importante.
La présence de ces répétitions peut provoquer des signaux non spécifiques du fait d'une hybridation croisée avec des sites homologues présents sur tout le génome, problème qui peut être minimisé en préhybridant la sonde avec un excès d'ADN total humain.
Cette préhybridation exploite le fait que les séquences hautement répétées se réassocient plus rapidement que les séquences uniques.
1- Répétitions centromériques :
Les séquences répétées de type satellite alpha sont localisées sur tous les centromères humains.
Elles sont composées d'un ensemble d'éléments de 171 paires de bases, répétés sur une distance totale allant jusqu'à 3 mégabases.
Plusieurs de ces sondes sont disponibles commercialement, déjà marquées.
Des sondes centromériques sont disponibles pour tout chromosome, à l'exception des chromosomes 13 et 21, ainsi que 14 et 22, qui s'hybrident entre eux.
Une autre famille de répétitions est la famille des satellites bêta, qui consiste en des éléments de répétition de 68 à 69 paires de bases.
2- Peintures chromosomiques :
Elles sont réalisées à partir d'un chromosome individuel isolé par cytométrie de flux, à partir de lignées humaines ou d'hybrides somatiques contenant seulement un chromosome humain.
L'ADN isolé est ensuite sous-cloné dans un vecteur plasmidique ou amplifié directement par PCR (polymerase chain reaction) en utilisant soit des amorces spécifiques de séquence Alu, soit des amorces dégénérées.
Ces peintures sont commercialisées maintenant pour tous les chromosomes et dans de nombreux cas, elles peuvent être obtenues, soit déjà marquées, soit directement conjuguées à une lamelle afin d'accélérer la réaction.
3- Sondes pour des régions chromosomiques spécifiques :
Elles sont fournies soit par microdissection de bandes chromosomiques distinctes, soit à partir d'hybrides somatiques irradiés contenant des segments spécifiques de chromosomes.
L'ADN est amplifié de la même manière que pour les peintures chromosomiques.
4- Sondes pour les loci chromosomiques spécifiques :
De nombreuses sondes contenant des régions génomiques spécifiques sont disponibles pour l'hybridation in situ.
En fonction du type de vecteur de clonage utilisé, des tailles différentes d'ADN peuvent être insérées.
Ces vecteurs sont :
- soit des plasmides permettant une insertion de 0,5 kb à 5 kb ;
- soit des phages
- 9 à 23 kb ;
- soit des cosmides
- 35 à 50 kb ;
- soit des vecteurs P1
- 70 à 85 kb ;
- soit des PAC (P1 -derived artificial chromosome)
- 100 à 120 kb ;
- soit des BAC (bacterial artificial chromosome)
- 120 à 150 kb ;
- et enfin des YAC (yeast artificial chromosome)
- 100 kb à plus de 2 Mb. Normalement, seules les sondes supérieures à 35 kb sont utilisées pour la FISH.
Même si des sondes plus petites peuvent être visualisées, leur sensibilité est généralement faible, empêchant l'analyse des clones minoritaires.
Certaines sondes permettant la détection de réarrangements chromosomiques spécifiques sont disponibles commercialement, par exemple celles permettant la détection des translocations t(9 ;22) ou t(15 ;17).
B - Substrats :
Le substrat habituel pour la FISH est une préparation chromosomique de métaphase ou d'interphase.
Pour l'analyse des métaphases, des lames fraîches permettent d'obtenir un meilleur résultat que des lames congelées, mais les culots chromosomiques fixés de manière prolongée à - 20°C sont également analysables.
Il est aussi possible de réaliser la FISH sur noyau interphasique de préparations cellulaires totales, telles que des cytospins, des étalements de sang ou de moelle osseuse et, au moins avec des sondes centromériques, sur des sections minces de tissus paraffinés ou des noyaux isolés à partir de tissus paraffinés.
C - Marquage de la sonde :
La sonde est marquée par incorporation le plus souvent de nucléotides marqués, soit à la biotine, soit à la digoxigénine, mais des nucléotides directement conjugués à des fluorochromes peuvent également être utilisés.
Typiquement la sonde est marquée par Nick-translation.
D'autres systèmes de marquage peuvent être utilisés tel l'amorçage aléatoire, ou la PCR.
D - Dénaturation de l'ADN et hybridation :
En chauffant l'ADN à une température proche de la température d'ébullition, la double hélice se sépare en simple brin.
L'ajout de formamide et la présence d'une faible concentration saline permettent la dénaturation à plus faible température, permettant la préservation de la morphologie chromosomique.
La sonde ADN et la cible ADN sont préalablement dénaturées séparément, puis mélangées pour hybridation.
Les lames sont ensuite lavées afin d'éliminer la fixation non spécifique de la sonde. L'inconvénient majeur des analyses par FISH est la présence de signaux non spécifiques (bruit de fond).
Plusieurs modifications techniques, tels l'utilisation de lames lavées, un prétraitement des chromosomes avec de la protéinase K ou de la pepsine et/ou de la ribonucléase et/ou la postfixation avec du formaldéhyde ou de l'acétone, peuvent minimiser ce risque, bien qu'elles allongent considérablement la procédure.
E - Détection de la sonde :
La localisation de la sonde est révélée soit par visualisation directe lorsque des nucléotides fluorescents ont été directement incorporés, soit par immunofluorescence indirecte en utilisant des anticorps dirigés contre la biotine ou la digoxigénine, conjugués à des fluorochromes.
Différents fluorochromes sont disponibles actuellement, y compris le FITC (isothiocyanate de fluorescéine), le Texas red, l'AMCA (acide 7-amino, 4-méthylscoumarine, 3-acétique), la rhodamine et le vert Rhodol. Le FISH en multicouleur permet la détection simultanée de différentes sondes en même temps.
De plus, l'utilisation de mélanges de différents fluorophores en rapport variable (ratio labelling) augmente le nombre de sondes qui peuvent être hybridées et détectées en même temps.
Après la détection des sondes, les chromosomes sont contre-colorés avec un colorant fluorescent comme le DAPI (diamidino-phénylindole dihydrochloride) ou l'iodure de propidium, permettant la visualisation microscopique des chromosomes et de la sonde en même temps.
Analyse de l'hybridation :
L'analyse des préparations en FISH est effectuée en utilisant un microscope fluorescent standard, ajusté avec des filtres appropriés.
Un système automatique d'analyse d'images est de plus en plus utilisé. à un appareil photo de type CCD (charge-coupled device), attaché au microscope, est associée une station de capture informatisée. Un logiciel approprié permet d'améliorer la visualisation des signaux.
De tels systèmes permettent la détection de signaux de plus en plus faibles, en raison de l'amplification du signal émis.
Les logiciels utilisés pour la manipulation des images permettent aussi la conversion des images de chromosomes colorés de manière fluorescente en un caryotype en bandes G conventionnel noir et blanc, très utile dans le cadre d'une localisation exacte de sondes et pour l'identification des chromosomes réarrangés.
En utilisant la technique de FISH, un signal spécifique fort peut être observé au site d'hybridation d'un chromosome spécifique.
La majorité des métaphases est informative et, typiquement, des signaux sont observés sur les deux chromatides d'une paire de chromosomes homologues.
Certains commentaires sont nécessaires à l'analyse de FISH appliquée aux échantillons hématologiques. Ainsi, il est possible qu'à côté du clone malin anormal, de nombreuses cellules normales soient présentes, conduisant à un clone anormal minoritaire par rapport à la majorité des mitoses.
D'autre part, il peut exister un certain nombre de sous-clones.
Il est donc nécessaire d'analyser un grand nombre de métaphases pour aboutir à un résultat fiable.
L'interprétation des analyses de FISH doit être associée à la connaissance du caryotype dans chaque cas.
Cependant, l'absence d'anomalie cytogénétique par analyse de chromosome conventionnelle n'exclut pas leur présence à un niveau microscopique ne pouvant être détecté que par la méthode de FISH.
A - FISH en interphase :
La détection d'anomalies chromosomiques par FISH sur noyau interphasique a l'avantage d'éviter la culture cellulaire et permet l'analyse d'un plus grand nombre de cellules qu'en métaphase. Par cette méthode, des informations caryotypiques peuvent être obtenues à partir d'échantillons ayant peu ou pas de mitoses analysables.
Cette méthode a été surtout appliquée aux anomalies de nombre (aneuploïdie), mais les sondes spécifiques peuvent permettre la détection des anomalies de structure, soit par la détection d'une colocalisation de deux sondes normalement situées sur deux chromosomes distincts, soit par la division du locus reconnu par la sonde lors d'un remaniement, aboutissant ainsi à trois signaux d'hybridation (deux sur les chromosomes dérivés de la translocation équilibrée, un troisième sur l'allèle normal).
Une évaluation précise des limitations de chaque sonde utilisée en FISH interphasique est indispensable, car une population de cellules monosomiques ou trisomiques peut être observée à l'intérieur des noyaux interphasiques chez des individus normaux, du fait des limitations techniques.
Ainsi, jusqu'à 5 % de cellules monosomiques en interphase peuvent être détectées chez des individus normaux, en raison d'une hybridation incomplète de la sonde ou d'un chevauchement des deux signaux.
De même, jusqu'à 2 % de cellules trisomiques peuvent être observées en raison du bruit de fond ou de rares cellules polyploïdes. Donc pour n'importe quelle analyse interphasique, il est important de déterminer d'abord la fourchette des valeurs normales pour chaque sonde utilisée, dans une population contrôle d'individus sains, et d'établir des limites de confiance autour de ces valeurs avant d'interpréter les résultats relatifs au groupe de patients.
Cette limite conduit à la non-détection de clones de petite taille.
De plus, une erreur d'interprétation peut survenir si les analyses sur interphase ne sont pas corrélées avec les anomalies observées sur métaphase.
A titre d'exemple, la coexistence d'une translocation sur un allèle et la perte de l'allèle normal, ou certaines translocations déséquilibrées, donneront un résultat faussement négatif en FISH interphasique si une seule sonde spécifique du point de cassure de la translocation est utilisée.
De la même manière, une telle translocation ne peut pas être distinguée d'une trisomie du chromosome en question.
Ceci souligne la nécessité d'inclure les contrôles et/ou sondes supplémentaires nécessaires afin de distinguer entre aneuploïdie et translocation chromosomique en analyse interphasique réalisée en « aveugle ».
B - Détection des anomalies chromosomiques :
1- Anomalies numériques :
L'aneuploïdie chromosomique est retrouvée fréquemment dans les hémopathies malignes. L'utilisation de sondes spécifiques de chromosome permet la détection rapide des métaphases qui sont soit monosomiques, soit trisomiques.
Les sondes les plus usuelles sont les répétitions centromériques et les peintures chromosomiques complètes qui donnent toutes deux des signaux forts, idéaux pour le criblage rapide de nombreuses mitoses.
Les sondes centromériques sont également adaptées à l'étude de noyaux interphasiques, mais il est généralement accepté que les peintures chromosomiques ne soient pas utilisables pour ce type d'étude, en raison de leur spectre trop large.
Les signaux très forts, associés à la possibilité d'analyse de mitose de mauvaise qualité et de noyaux interphasiques, expliquent que la FISH soit de plus en plus utile pour identifier des anomalies chromosomiques numériques.
L'analyse interphasique avec des sondes répétées centromériques a été utilisée avec succès pour détecter des clones non proliférants dans certaines hémopathies, comme par exemple les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), où l'analyse chromosomique est rendue difficile par le faible indice mitotique.
En dépit de l'utilisation de nombreux mitogènes des cellules B, le taux de détection de caryotypes anormaux par les méthodes de cytogénétique conventionnelle, était de l'ordre de 50 %.
L'incidence classique de la trisomie 12 est augmentée de l'ordre de 10 à 20 % après analyse en FISH sur noyau interphasique.
2- Anomalies de structure :
La FISH peut être aussi utilisée pour identifier la présence d'anomalies chromosomiques de structure.
Cette approche est particulièrement pratique pour définir les réarrangements chromosomiques présents dans un caryotype complexe, et pour identifier l'origine chromosomique de chromosomes marqueurs ou non identifiés.
L'analyse par FISH a été une aide précieuse dans les cas où les anomalies sont difficiles à observer caryotypiquement, soit parce que l'anomalie est subtile ou « parfaitement équilibrée », soit à cause de la mauvaise qualité de la préparation chromosomique, typique de certaines maladies.
L'approche la plus simple permettant la détection des réarrangements structurels, est l'utilisation de peintures chromosomiques.
Cependant, il existe un certain nombre de limites. Les peintures chromosomiques sont généralement d'un faible intérêt dans les régions télomériques et donc ne peuvent être utilisées pour déterminer la présence de petites translocations terminales.
De même, elles sont difficiles à utiliser en analyse interphasique.
Elles ne permettent pas non plus d'identifier des réarrangements intrachromosomiques, et elles ne fournissent pas d'information précise sur la région chromosomique impliquée dans le réarrangement structurel.
Certains de ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant des peintures obtenues à partir de régions chromosomiques spécifiques.
On peut aussi avoir recours à des sondes spécifiques.
Les translocations télomériques sont souvent difficiles à bien caractériser. Par exemple, la FISH a montré que chez certains cas décrits comme correspondant à une délétion du bras long du chromosome 11, une translocation faisant intervenir le bras long du chromosome 6 était présente, permettant l'obtention d'un caryotype exact. De la même manière, l'utilisation des sondes de la chaîne lourde des immunoglobulines (IgH) en 14q32 permet l'identification de translocations réciproques chez les patients ayant une translocation d'origine inconnue aboutissant à un chromosome 14 anormal.
D'autres translocations équilibrées sont extrêmement difficiles, voire impossibles à voir par caryotype classique, dans la mesure où les chromosomes transloqués ressemblent trop à leurs équivalents normaux.
La t(12 ;21) impliquant les gènes TEL et AML1, exemple, est seulement détectable par FISH, ou par techniques moléculaires.
Dans la mesure où cette anomalie est retrouvée dans environ 25 % des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) de l'enfant et semble identifier un sous-groupe de bon pronostic, il deviendra bientôt indispensable de dépister ces LAL au diagnostic, soit par FISH, soit par PCR, afin de stratifier le traitement selon le risque de rechute.
L'origine précise des chromosomes marqueurs peut être déterminée par peinture inverse.
Les chromosomes marqueurs sont soit microdisséqués à partir de cellules métaphasiques anormales, soit isolés par cytométrie de flux.
Le matériel chromosomique collecté est ensuite amplifié par PCR afin d'obtenir une peinture spécifique de ce marqueur, puis cette peinture est hybridée sur des métaphases normales, permettant ainsi d'identifier la région chromosomique constituant le marqueur.
Mais, même lorsque la bande exacte a été identifiée par cette méthode, aucune information précise n'est obtenue sur les gènes impliqués à l'intérieur de ces réarrangements, du fait de la présence de nombreux gènes pouvant être impliqués à l'intérieur d'une bande chromosomique.
Ainsi des réarrangements récurrents de la bande 11q23 ont été rapportés dans une variété de pathologies malignes hématologiques comprenant des LAL, des LAM (leucémies aiguës myéloïdes), des syndromes myélodysplasiques et des lymphomes.
Dans certains cas, le gène MLL est impliqué, mais dans d'autres cas, d'autres gènes à l'intérieur de la bande 11q23 ont été impliqués.
Dans certains cas, il est important de confirmer ou d'exclure la présence de réarrangements chromosomiques spécifiques, afin de clarifier un diagnostic avant le début de traitement.
Dans les cas où une anomalie attendue n'est pas observée, telle l'absence d'un chromosome de Philadelphie [t(9 ;22) ou Phl] chez un malade atteint de leucémie myéloïde chronique (LMC), l'analyse par FISH fournit une aide importante à l'analyse chromosomique conventionnelle du fait qu'elle peut démasquer la présence d'une translocation cryptique, due à l'insertion d'un fragment sous-microscopique d'un chromosome dans l'autre, et aussi permettre l'analyse des cellules qui ne prolifèrent pas, problème particulier dans les LMC traitées par l'interféron.
Une analyse moléculaire par PCR permet également la mise en évidence de l'équivalent moléculaire de la t(9 ;22), le remaniement BCR-ABL, dans ces cas Ph1-négatifs, mais ne permet pas de déterminer l'origine de l'absence d'informativité par caryotype classique. La mise en évidence ou non de translocations caractéristiques entre le chromosome 8 et les chromosomes 14 [t(8 ;14)(q24 ;q32)], 2 [t(2 ;8)(q32 ;p12)] ou 22 [t(8 ;22)(q24 ;q11)], peut aider au diagnostic de lymphome de Burkitt ou son équivalent leucémisé (LAL L3).
Les points de cassure du chromosome 8q24 s'étendent sur plusieurs centaines de kilobases soit en 3', soit en 5'du gène c-myc, ce qui rend difficile ou impossible leur détection par PCR ou southern-blot dans un délai compatible avec l'urgence clinique.
L'analyse par FISH avec des sondes spécifiques de cette translocation, peut fournir un résultat en 2 jours et représente une méthode de dépistage de choix.
Deux sondes YAC, couvrant l'ensemble des points de cassure sur le chromosome 8q24, peuvent détecter la présence de réarrangement chromosomique au niveau de ce locus, à la fois en métaphase et en interphase.
En général, cette approche est intéressante quand les points de cassure sont dispersés.
Une approche différente est représentée par l'utilisation de deux sondes complémentaires, choisies de part et d'autre de la région du point de cassure.
Dans une cellule normale, les sondes seront colocalisées, tandis que dans une cellule comportant une translocation, les signaux seront séparés, comme dans le cas de translocations impliquant le locus de la chaîne lourde des immunoglobulines. à l'inverse, des sondes jouxtant les points de cassure de deux chromosomes partenaires impliqués dans la translocation, peuvent être utilisées.
Dans une cellule normale, les signaux seront séparés sur chaque chromosome respectif, tandis que dans une cellule ayant une translocation, le signal sera colocalisé.
Il existe de nombreux exemples, telles les translocations t(9 ;22)(q34 ;q11), t(8 ;21)(q22 ;q22) et t(15 ;17)(q22 ;q11-12).
Pour ce type d'analyse, les sondes peuvent être marquées soit avec le même fluorophore soit, afin d'augmenter la sensibilité et la specificité, avec des fluorophores différents.
Un certain nombre de délétions spécifiques ont été décrites où la perte d'un gène suppresseur de tumeur sur un allèle, associée à son inactivation sur l'autre allèle, contribue au processus malin. Dans certains cas, le gène a été identifié, tel Rb1 en 13q14.
Mis à part les limitations de détection des monosomies, l'utilisation de sondes spécifiques de ces gènes a permis une augmentation de détection de la perte de gènes suppresseurs de tumeurs.
Dans une cellule normale, deux signaux seront observés, mais en présence d'une délétion, seul un signal sera observé dans les cellules anormales.
Applications en hématologie :
A - Indications pratiques :
Malgré le nombre important de sondes décrites, une disponibilité commerciale dorénavant limitée restreint leur application dans un laboratoire de cytogénétique hématologique de routine.
Il existe, cependant, un certain nombre de réseaux de recherche appliquée qui visent à faciliter la distribution des sondes bien caractérisées, et le nombre de sondes disponibles commercialement augmente rapidement.
De la même manière, malgré une évolution rapide dans les développements technologiques, la plupart de ces techniques sont longues, fastidieuses et fréquemment dépendantes de la disponibilité d'équipements spécialisés.
En règle générale, l'application des techniques FISH est limitée à des cas sélectionnés, selon les résultats en caryotype classique.
1- Détection d'aneuploïdie :
Les anomalies de nombre (aneuploïdie) sont retrouvées fréquemment dans les hémopathies malignes et certaines d'entre elles sont retrouvées d'une manière préférentielle dans un sous-type particulier, tel que la trisomie 12 dans les LLC, la trisomie 8 dans les LAM et syndromes myélodysplasiques, et la monosomie 7 dans les syndromes myélodysplasiques.
L'utilisation des centromères pour ces chromosomes a augmenté le taux de détection d'aneuploïdie.
La précision accrue qu'une analyse en FISH peut apporter à l'incidence de ces aneuploïdies, ainsi qu'à la proportion des blastes portant l'anomalie, rend nécessaire une réévaluation de la valeur pronostique de ces aneuploïdies.
Le dépistage par FISH permet l'évaluation rapide d'un nombre plus important de cellules et une quantification plus précise de la représentativité du clone.
L'analyse en FISH peut également clarifier l'origine chromosomique de l'aneuploïdie.
Il faut cependant souligner qu'à l'heure actuelle, la détection de ces anomalies du nombre n'entre pas dans la stratification thérapeutique.
2- Caractérisation des anomalies complexes :
Devant un caryotype complexe, constitué de plusieurs anomalies structurales, une classification basée uniquement sur les bandes G ou R, peut être difficile à obtenir. Dans ces cas, l'utilisation de peintures chromosomiques aide l'identification des chromosomes impliqués dans les remaniements structuraux, et les sondes centromériques peuvent clarifier l'origine des translocations impliquant un bras entier.
3- Détection des anomalies spécifiques :
Des sondes spécifiques d'un nombre croissant de translocations sont disponibles commercialement.
Un kit permettant la détection de la translocation t(9 ;22), aboutissant à un remaniement entre les gènes BCR et ABL a été le premier a être commercialisé.
Certains kits permettent la détection simultanée des t(9 ;22) impliquant le M-BCR (p210) des LMC et ceux impliquant le m-BCR (p190) des LAL de la lignée B.
L'utilisation des kits BCR-ABL en FISH peut clarifier l'interprétation des mitoses avec anomalies complexes, ainsi que permettre l'identification d'un remaniement BCR-ABL dans des cas sans t(9 ;22) classique (c'est-à-dire des translocations « cryptiques »).
Ceci peut résulter de deux situations : d'une part la mise en évidence d'une insertion de BCR dans le locus ABL d'un chromosome 9 normal, ou vice-versa, et d'autre part, la mise en évidence du remaniement BCR-ABL uniquement dans les noyaux interphasiques.
La deuxième catégorie correspond à un clone pathologique qui ne prolifère pas dans les conditions de culture in vitro.
A l'heure actuelle, toute LMC Ph-négative et toute LAL de la lignée B chez l'adulte sans t(9 ;22) doivent bénéficier d'un dépistage moléculaire de remaniement BCR-ABL, soit par FISH, soit par RT-PCR ou southern.
Des sondes existent également pour la détection par FISH de la t(15 ;17), associée spécifiquement avec des LAM à promyélocytes (type M3 de la classification FAB).
Cette translocation aboutit à un remaniement entre le gène PML sur le chromosome 15 et le gène RARA sur le chromosome 17.
Ces sondes sont particulièrement utiles devant une LAM3 sans anomalie t(15 ;17) par cytogénétique classique.
Il existe également des sondes pour la détection de l'inversion du chromosome 16, dont le diagnostic par caryotype classique peut être difficile, surtout après analyse en bande R. Malheureusement ces sondes s'hybrident d'une manière non spécifique avec d'autres régions du génome.
L'intérêt relatif de la détection de ces anomalies par FISH par rapport à la détection de leur transcrit de fusion par RT-PCR est en cours d'évaluation.
Seule l'analyse en FISH permet une évaluation anatomique du mécanisme aboutissant à l'anomalie moléculaire, mais il semble que ce mécanisme ait peu d'influence sur le pronostic.
Dans l'autre sens, la détection de ces anomalies par technique moléculaire représente une solution idéale quand il n'y a pas de matériel pour analyse cytogénétique.
L'analyse en FISH se prête mieux à une évaluation « cas par cas », mais à l'inverse, la détection des transcrits de fusion par RT-PCR s'adapte mieux à l'analyse des grandes séries.
D'autres sondes spécifiques sont commercialement disponibles : par exemple du locus MLL sur le chromosome 11q23 ; de MYC sur le chromosome 8q24, ce qui permet la détection de la translocation t(8 ;14)(q24,q32) des lymphomes de Burkitt ou de leur équivalent leucémisé, mais pas des translocations variantes t(2 ;8)(p12 ;q24) ou t(8 ;22 ;q24 ;q11).
Il existe également des sondes pour la détection des délétions du locus p53 sur le chromosome 17p13 et pour les délétions du bras long du chromosome 5 en 5q31.
Les délétions de cette région se retrouvent fréquemment dans les syndromes myélodysplasiques et dans certaines LAM.
Plusieurs autres sondes chromosomiques sont disponibles dans le secteur commercial, mais leur spécificité n'est pas toujours très bien précisée et elles sont à utiliser avec précaution.
4- Suivi du chimérisme postgreffe de moelle :
Des sondes spécifiques pour les chromosomes X et Y sont parfaitement adaptées au suivi par cytogénétique moléculaire des greffes de moelle allogénique avec mismatch de sexe.
Ces sondes permettent l'évaluation du degré de chimérisme, ainsi que l'identification précoce des rechutes, en étudiant la présence ou non du chromosome X ou Y sur noyau interphasique.
B - FISH en tant que méthode de recherche en hématologie :
L'analyse en FISH fournit une étape intermédiaire très importante entre la cytogénétique conventionnelle et la biologie moléculaire dans l'analyse des remaniements chromosomiques.
Elle est souvent utilisée comme point de départ dans la caractérisation de nouveaux réarrangements, en aidant à la localisation des points de cassure.
Des sondes progressivement plus ciblées peuvent ensuite être utilisées pour préciser le point de cassure et éventuellement sa position vis-à-vis d'autres gènes dans la région.
Le projet de séquençage du génome humain fournit un nombre croissant de sondes spécifiques pour ces analyses de cartographie positionnelle.
Les techniques de FISH sont particulièrement utiles pour cartographier les délétions, dans la mesure où les techniques moléculaires, telles l'analyse de RFLP (polymorphisme de longueur des fragments de restriction) ou l'évaluation du dosage génomique par southern ou par analyse de perte d'hétérozygotie ont chacune des limitations.
L'analyse par FISH a permis la détermination des régions minimales délétées, sur le bras long du chromosome 5[del (5q)], associées aux LAM et aux syndromes myélodysplasiques et sur le bras long du chromosome 6 [del (6q)], associées aux lymphomes et aux LAL.
La localisation de ces points de cassure peut donner une idée du mécanisme de réarrangement chromosomique et des gènes impliqués. La spécificité des points de cassure pour certains réarrangements chromosomiques signifie que leur localisation peut être aisément réalisée par PCR ou par analyse par la méthode de southern.
Cependant pour d'autres réarrangements chromosomiques, du fait d'un grand nombre de points de cassure, la détection est rendue difficile par ces méthodes et l'identification du point de cassure précis nécessite un travail laborieux.
En utilisant une série de sondes, la région du point de cassure peut être rapidement définie par FISH, permettant de diminuer le nombre d'analyses nécessaire par la méthode de southern, comme dans le cas des t(11 ;14)(q13 ;q32) associées à des proliférations lymphoïdes B matures, plus particulièrement dans les lymphomes du manteau, et les t(8 ;14)(q24 ;q32) associées au lymphome de Burkitt.
C - Immuno-FISH :
La méthode de FISH peut être associée à un marquage immunohistochimique ou immunofluorescent d'une sous-population particulière, permettant l'identification de l'origine cellulaire de l'anomalie cytogénétique.
Cette méthode a été nommée immuno-FISH ou FICTION.
Elle a de nombreuses applications, comme dans les LLC à caryotype normal, où l'immunophénotypage et l'analyse caryotypique séquentielle ont montré que les cellules en mitose étaient des lymphocytes T non leucémiques. à l'inverse, l'utilisation simultanée d'une sonde centromérique du chromosome 12 et d'une sonde du locus Rb1 (chromosome 13q14) a montré que les anomalies chromosomiques étaient restreintes à la lignée lymphoïde B.
Dans les LAM, la monosomie 7 est présente dans pratiquement toutes les cellules myélomonocytaires et érythrocytaires, mais est absente des lymphocytes. Dans les syndromes myélodysplasiques, la trisomie 8 est présente dans les granuleux, les monocytes, les éosinophiles et les basophiles, mais est absente des lymphocytes.
La capacité à cibler la population à analyser peut augmenter la sensibilité de détection des événements rares.
Une autre application est représentée par le suivi des effets du traitement des facteurs de croissance sur des populations cellulaires soit clonales, soit non clonales.
D - Suivi de la maladie résiduelle et comparaison de l'intérêt relatif de la FISH et de la PCR :
La détection de la maladie résiduelle joue un rôle de plus en plus important dans le suivi des malades atteints d'hémopathies malignes.
La capacité à analyser rapidement un grand nombre de cellules rend l'analyse en FISH plus appropriée que celle en cytogénétique classique, où la sensibilité est limitée par le nombre de mitoses et le temps d'analyse. Une technique, appelée hypermétaphase FISH (HMF), qui consiste à pousser les conditions de culture afin de maximiser le nombre de mitoses analysables en FISH, s'est montrée plus performante que l'analyse en cytogénétique classique pour le suivi de la t(9 ;22) dans les LMC.
L'analyse en FISH interphasique augmente considérablement le nombre de cellules analysables, bien que, pour des raisons détaillées ci-dessus, la détection des événements rares par cette technique soit limitée par le bruit de fond.
Sa sensibilité est normalement limitée à environ 1 %.
L'utilisation de deux fluorophores augmente la spécificité de l'hybridation et peut donc améliorer la sensibilité.
Une analyse en FISH représente la technique de choix pour le suivi des anomalies de nombre.
Les LAL de l'enfant, par exemple, sont souvent caractérisées par un caryotype hyperdiploïde.
La détection par FISH en multifluorescence des chromosomes trisomiques permet une amélioration de la détection d'une cellule tumorale parmi les cellules normales.
Pour ce qui concerne le suivi des anomalies structurales, un nombre croissant peut être détecté soit par FISH, soit par PCR à partir de l'ARN ou de l'ADN.
Chaque approche a ses avantages et ses inconvénients, mais le choix se fait très souvent selon la disponibilité locale de l'expertise technique appropriée.
L'analyse en FISH a l'avantage de permettre l'identification de l'origine cellulaire de l'anomalie par immuno-FISH et d'être facilement quantifiable.
La PCR, en revanche, est mieux adaptée à l'analyse d'un grand nombre d'échantillons et est plus capable de détecter des événements rares dans le cadre de la maladie résiduelle, bien que les études de comparaison directe soient peu nombreuses.
E - Développements récents :
Hybridation génomique comparative :
Récemment, la méthode d'hybridation in situ du génome entier, l'hybridation génomique comparative (HGC), a été développée.
Elle permet une détection plus précise de l'amplification (gain) ou de la délétion (perte) chromosomique, anomalies qui ne sont pas toujours détectables par l'analyse cytogénétique conventionnelle, surtout lorsqu'elles font partie d'un caryotype complexe.
L'HGC est basée sur l'hybridation comparative in situ entre de l'ADN tumoral et de l'ADN normal, marqués avec des fluorochromes différents, sur des chromosomes métaphasiques humains normaux.
Les profils d'hybridation de l'ADN tumoral et normal le long de chaque chromosome sont ensuite analysés par examen du rapport des deux fluorochromes.
L'hybridation de l'ADN normal sur la lame de contrôle est étudiée en premier.
Ensuite, une comparaison est faite entre les taux de marquage des deux fluorochromes obtenus lors du mélange de l'ADN normal avec l'ADN tumoral.
Seules des différences dans le rapport de marquage supérieures aux valeurs de fluctuations normalement vues dans le contrôle d'hybridation, sont considérées comme un signe de gain ou de perte dans le matériel tumoral.
L'HGC peut être appliquée à tout type d'échantillons, sans la nécessité de culture cellulaire in vitro.
Ne dépendant pas de la présence de mitoses tumorales, l'HGC permet la détection d'anomalies clonales dans les échantillons pour lesquels les cellules en mitoses sont difficiles à obtenir ou pour lesquels la morphologie chromosomique est complexe.
De plus, cette méthode n'est pas basée sur l'analyse d'une région chromosomique particulière, étant une méthode globale qui fournit une image des gains ou pertes du matériel génétique sur l'ensemble du génome, même dans le cas de caryotypes très complexes.
Le caryotype généré par HGC, défini comme le caryotype à nombre de copies (copy number karyotype) est bien adapté à l'analyse des lymphomes.
Cependant, elle ne peut se substituer à la cytogénétique conventionnelle et aux études de FISH, car elle ne peut détecter de réarrangements chromosomiques équilibrés dans lesquels il n'y a ni perte, ni gain de matériel chromosomique.
F - Cartographie des gènes par FISH :
Préalablement à leur utilisation dans la détection des réarrangements chromosomiques spécifiques, toute sonde doit être localisée physiquement sur une région chromosomique particulière.
Ceci peut être réalisé en appliquant la sonde sur des chromosomes de métaphase ou de prométaphase, sur lesquels la localisation du signal peut être directement visualisée en bandes G.
Alternativement, le procédé inverse de mise en bande G suivi de la procédure de FISH peut être réalisé ou, plus récemment, les bandes chromosomiques R ou G peuvent être converties à partir de chromosomes marqués de manière fluorescente par un système d'analyse d'images.
En analyse métaphasique, il est possible d'établir l'ordre chromosomique de deux ou trois sondes étroitement associées par FISH en double ou triple couleur, si elles sont séparées par une distance physique de plus de 2 à 3 Mb.
Pour des analyses prométaphasiques, la résolution est supérieure à 1 mégabase et sur cellule interphasique, dans laquelle la chromatine est à peu près 20 fois moins condensée que dans la chromatine métaphasique, la sensibilité de l'ordonnancement des sondes est de l'ordre de 50 à 1 000 kb.
L'étirement mécanique de chromosomes réalisé par cytocentrifugation de cellules hypotoniques, fournit une autre cible possible, permettant la haute résolution de cartographies par FISH sur des distances s'étendant entre 300 et 3 000 kb.
Encore plus résolutives, les techniques de FISH sur de l'ADN fibrillaire libèrent des fibres chromatiniennes de cellules bloquées en phase G1 ou G2 du cycle cellulaire, et fournissent une définition de l'ordre de 1 à 300 kilobases. L'utilisation de multiples fluorophores augmente encore la résolution.
Cette technique peut être appliquée à la cartographie des points de cassure chromosomiques. L'utilisation d'une série de sondes marquées différemment, et qui forment entre elles une carte contiguë (un « contig ») de plusieurs centaines de kilobases, peut générer des images qui ressemblent à une configuration de « code-barres » pour le locus en question.
Ces techniques ont été appliquées au locus BCL1 et CCND1 sur le chromosome 11q13.
Devant un remaniement à l'intérieur de cette région, le « code-barre » est interrompu, permettant ainsi une localisation précise du point de cassure.
Vaandranger et al ont ainsi pu localiser les points de cassure dans 95 % des lymphomes du manteau, par rapport à seulement 50 % après analyse par hybridation en southern.
Aspects futurs :
Une avancée très prometteuse de l'analyse cytogénétique est apparue sous la forme de deux nouvelles approches appelées FISH en multiplex et caryotype spectral.
Ces méthodes sont basées sur l'utilisation des logiciels informatiques permettant une discrimination fine à l'intérieur d'une famille de fluorochromes et ainsi la détection et la discrimination de 27 types de fluorescences différentes, à partir d'une hybridation simultanée de plusieurs sondes.
Le résultat est un ensemble hautement coloré du génome entier humain, permettant la détection d'anomalies chromosomiques simples ou complexes, y compris celles qui n'ont pas été définies précisément par analyse cytogénétique conventionnelle.
La résolution du caryotype spectral est estimée à 500-1500 kb par rapport à environ 2 Mb par caryotype classique.
Le codage coloré de chaque chromosome rend moins indispensable la connaissance approfondie de cytogénétique.
Cependant, il est probable que le plus haut niveau de précision surviendra lors de l'association de l'analyse conventionnelle de bandes chromosomiques aux images de FISH en multiplex ou à l'hybridation de sondes simples copies, permettant de définir précisément les points de cassure et la composition de ces réarrangements.
Il faut cependant souligner qu'il existe des limitations de la FISH en multiplex.
Comme pour toute peinture chromosomique, les inversions paracentriques, certaines inversions péricentriques, les insertions impliquant un seul bras chromosomique, les petites duplications et certaines délétions peuvent ne pas être détectées.
Mis à part ces limitations, l'apparition continue de nouvelles technologies prometteuses, appliquées de manière complémentaire aux techniques préexistantes, permettra le développement de la cytogénétique classique et moléculaire lors du suivi des patients atteints de pathologie maligne hématologique.
Ces techniques vont révolutionner notre capacité à classifier, à comprendre et à stratifier selon le pronostic les leucémies et (surtout) les lymphomes.
