Warning: settype() expects parameter 2 to be string, array given in /home/mochb/public_html/header.php on line 88 Cytologie du sang normal - NewsDoc - Cours de médecine / annonces gratuites
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L'étude des cellules sanguines est faite classiquement au microscope sur des frottis colorés.
Actuellement les appareils automatiques se généralisent et quel que soit leur principe, ils donnent tous des appréciations quantitatives des différents éléments ainsi qu'une formule leucocytaire.
L'interprétation au microscope est réservée aux cas où des anomalies quantitatives sur les lignées sont observées et où des difficultés d'identification des leucocytes sont signalées par une alarme.
Le pourcentage des lames relues dépend du type d'appareil utilisé et du recrutement spécifique de chaque laboratoire.
Le retour à la technique traditionnelle est alors nécessaire.
Celle-ci comporte la confection des frottis, la coloration et la lecture au microscope (voir aussi dans ce traité, les chapitres consacrés à ces techniques).
La confection d'un frottis sanguin se fait manuellement à partir d'un échantillon de sang veineux prélevé sur anticoagulant.
Le recours au frottis fait lors d'un prélèvement capillaire au bout du doigt ou au talon est plus rare aujourd'hui ; en effet des microtubes sont proposés pour les prélèvements veineux des enfants, de plus, dans certaines situations pathologiques nécessitant des prélèvements répétés, des cathéters centraux sont mis en place.
La coloration du frottis peut être manuelle ou automatisée.
La coloration combinée de May-Grünwald-Giemsa (MGG), dite coloration panoptique de Pappenheim, et celle de Wright (plus volontiers utilisée aux Etats-Unis et en Grande-Bretagne) ont succédé à l'ancienne coloration aux triacides d'Ehrlich modifiée par Romanovski.
Les colorants de ce groupe contiennent du bleu de méthylène (colorant basique) et de l'éosine (colorant acide) dans différentes proportions, les colorations diffèrent aussi par la méthode utilisée pour activer le bleu de méthylène.
Les structures acidophiles de la cellule seront colorées en rose, rouge ou orangé, les structures basophiles en bleu (bleu clair, bleu foncé, bleu violet, pourpre).
Parmi ces colorants, le MGG est celui qui donne les résultats les plus complets avec les couleurs les plus brillantes. L'alcool utilisé pour dissoudre le colorant de May-Grünwald sert, en outre, de fixateur.
La lecture au microscope comporte une analyse de la morphologie des cellules des trois lignées, l'appréciation semi-quantitative des globules blancs et des plaquettes et l'établissement d'une formule leucocytaire sur 100 éléments nucléés. On corrèle enfin toutes ces constatations aux données de l'automate et on vérifie la raison de l'alarme éventuelle.
Globules rouges :
Les globules rouges sur frottis ont une forme circulaire, une taille uniforme avec un diamètre moyen de 8 μm (de très petites variations de taille ou de forme sont observées normalement), une coloration gris rosé avec un centre plus clair qui se fond graduellement à un anneau périphérique plus coloré.
L'observation des globules rouges est particulièrement utile lors d'une anémie car certaines anomalies peuvent être diagnostiques ou aider à la compréhension du mécanisme de cette anémie.
L'analyse doit porter sur :
- la taille, afin de signaler une éventuelle anisocytose, une macrocytose ou une microcytose ;
- la colorabilité, pour apprécier la normochromie, une hypochromie ou une polychromatophilie ;
- la forme, pour mettre en évidence une poïkilocytose non systématisée ou bien une anomalie de forme plus spécifique, telles une drépanocytose, une ovalocytose, une sphérocytose, une schizocytose ou la présence d'hématies en larme ;
- la présence éventuelle d'inclusions intraérythrocytaires comme des corps de Jolly, des ponctuations basophiles ou un éventuel parasitisme.
Le phénomène des rouleaux est un phénomène normal dû à la propriété qu'ont les hématies de s'accoler par leurs faces, d'une manière réversible, lorsqu'elles se trouvent dans le plasma (disposition en « pile d'assiettes ») ; en cas d'hyperglobulinémie ou d'hyperfibrinogénémie, cette agrégation est anormale et donne des rouleaux plus longs et de cohérence plus forte qui peuvent ainsi être observés sur les frottis.
Dans les cas d'hyperviscosité avec polyglobulie, les hématies sont accolées et superposées comme lorsque les frottis sont trop épais, y compris dans les franges ; par contre les leucocytes paraissent bien étalés et faciles à analyser.
Des agglutinats de globules rouges variables en taille et en nombre sont observés dans les cas d'anémie hémolytique avec agglutinines froides. Il est nécessaire alors de contrôler l'hémogramme et de refaire un frottis sur un sang placé à 37 °C dès le prélèvement.
Réticulocytes :
Le réticulocyte est issu d'un érythroblaste acidophile qui vient d'expulser son noyau.
Il reste un à deux jours dans la moelle puis circule un à deux jours dans le sang avant de devenir un globule rouge mûr.
Il se distingue de celui-ci par la persistance de diverses organelles, en particulier de l'ARN ribosomal, qui ne sont pas visibles au MGG.
Certains colorants, tels le bleu de crésyl brillant ou le bleu de méthylène nouveau, en se fixant sur l'ARN, forment un précipité d'aspect réticulé, visible au microscope.
C'est ainsi qu'il est possible d'identifier et de quantifier les réticulocytes. En cas d'hyperréticulocytose, il est possible, sur un frottis coloré au MGG, de reconnaître les réticulocytes, en raison de leur coloration polychromatophile, mais leur quantification reste très incertaine.
Actuellement, avec le développement de l'automatisation des comptages cellulaires, diverses méthodes de mesure automatisées ont été proposées pour les réticulocytes ; elles risquent de se généraliser dans les années à venir.
Plaquettes :
Elles se présentent sous forme d'éléments arrondis de petite taille, de 1 à 2 μm de diamètre, à contours irréguliers, de coloration gris clair, parsemés de fines granulations rosées. Un petit nombre de grandes plaquettes (de 7 μm de diamètre) peuvent être vues, elles correspondent vraisemblablement à de jeunes plaquettes.
Sur un frottis prélevé au bout du doigt (sans anticoagulants), les plaquettes auront tendance à se présenter sous forme d'agrégats.
L'observation des plaquettes sur lame a pour but :
- la recherche d'agrégats sur frottis de sang prélevé sur anticoagulant pour détecter les pseudothrombopénies à l'EDTA ou au citrate ;
- l'analyse de la taille et des anomalies des grains pouvant faire évoquer une thrombopathie constitutionnelle ou acquise.
Ces données sont à confronter aux résultats de l'automate, en particulier la courbe des plaquettes et le volume moyen plaquettaire.
La durée de séjour des plaquettes dans le sang est de 8 à 10 jours et le temps de transit médullaire des mégacaryocytes de 8 jours.
Polynucléaires neutrophiles :
Ce sont des cellules arrondies de 12 à 14 μm de diamètre, caractérisées par la forme plurilobée de leur noyau (3 à 5 lobes).
Les lobes sont réunis par de fins filaments de substance nucléaire qui ne sont pas toujours visibles si les lobes sont partiellement superposés ; parfois un des lobes présente un petit appendice appelé le corpuscule de Barr qui correspond à un chromosome X.
La chromatine est dense, formée de masses sombres séparées par de petites bandes plus claires.
Le cytoplasme contient d'assez nombreuses granulations assez fines, beige rosé, qui correspondent aux granulations spécifiques neutrophiles.
Les granulations azurophiles ont à ce stade de la maturation perdu leur affinité tinctoriale et ne sont presque plus visibles en optique.
Les « band cells » ou polynucléaires neutrophiles à noyau non segmenté diffèrent des précédents par leur chromatine qui est un peu moins dense et par la segmentation du noyau qui est incomplète ; le noyau est déjà incurvé et présente une ébauche de lobes séparés par des ponts assez larges de substance nucléaire.
Dans un sang normal, il existe environ 5 % de « band cells » qui sont assimilés aux polynucléaires dans le décompte de la formule leucocytaire.
Dans les pays anglo-saxons, les polynucléaires non segmentés apparaissent dans la formule sanguine, et l'élévation de leur pourcentage fait évoquer un syndrome infectieux ou inflammatoire.
L'observation d'anomalies nucléaires et cytoplasmiques des polynucléaires peut être révélatrice d'affections constitutionnelles ou acquises ; on observe ainsi des anomalies de forme nucléaire : hypersegmentation (au cours des anémies mégaloblastiques), hyposegmentation ou absence de segmentation nucléaire (anomalie de Pelger-Hüet), présence d'appendices nucléaires supplémentaires.
Des anomalies des grains sont aussi observées : les granulations azurophiles peuvent être bien visibles et nombreuses ; cette image de polynucléaires dits à « grains toxiques » correspond à un temps de transit médullaire accéléré des granuleux, lors d'un syndrome infectieux ou d'une régénération médullaire granuleuse.
Au contraire, les granulations peuvent être à peine visibles, donnant au cytoplasme un aspect peu granuleux, voire agranulaire, évocateur d'affections acquises du type myélodysplasie ou leucémie.
Parmi les inclusions intracytoplasmiques, les corps de Döhle sont fréquemment observés.
Ils sont associés aux grains toxiques et observés dans les mêmes circonstances ; il s'agit de petites plages d'intense basophilie correspondant à un reste d'ARN.
Il existe par ailleurs des inclusions ressemblant aux corps de Döhle, mais qui en diffèrent sur le plan ultrastructural, dans les polynucléaires de la maladie de May-Hegglin.
D'autres inclusions intracytoplasmiques sont observées dans des affections constitutionnelles tel le syndrome de Chediak-Higashi ou les diverses mucopolysaccharidoses ; il faut noter que, dans ces affections, des inclusions sont aussi retrouvées dans d'autres cellules comme les polynucléaires éosinophiles, les monocytes ou les lymphocytes.
La durée du séjour dans le sang des polynucléaires neutrophiles est de 2 jours avant leur passage tissulaire.
Le temps de transit médullaire des précurseurs granuleux est de 10 à 14 jours ; il existe un compartiment de réserve médullaire des polynucléaires neutrophiles.
Polynucléaires éosinophiles :
Ce sont des cellules de 12 à 14 μm de diamètre caractérisées par un noyau bilobé et surtout par l'aspect des granulations qui sont sphériques (0,5 à 1,5 m de diamètre), réfringentes, de coloration orangée et assez nombreuses à l'intérieur du cytoplasme.
L'étude ultrastructurale montre que les grains éosinophiles les plus mûrs contiennent un cristal central, non visible en optique.
Dans les hyperéosinophilies, quelle qu'en soit la cause (parasitose, allergie, etc.), on observe une augmentation du nombre de lobes nucléaires et un certain nombre de cellules comportent des plages de cytoplasme dépourvu de grains.
La durée de séjour dans le sang est de 12 à 24 heures avant leur passage tissulaire et le temps de transit médullaire est comparable à celui du polynucléaire neutrophile.
Polynucléaires basophiles :
Ce sont des cellules de 10 à 14 μm de diamètre. Leur noyau bilobé est masqué par des granulations spécifiques qui sont assez nombreuses et dispersées sur toute la cellule.
Elles sont arrondies (0,2 à 1 m de diamètre) ou plus souvent angulaires, de coloration pourpre.
La durée de séjour dans le sang est de 12 à 24 heures, sans passage tissulaire connu, le temps de transit médullaire serait identique à celui du polynucléaire neutrophile.
Monocytes :
Ce sont de grandes cellules de taille variable (20 à 40 μm de diamètre).
Le noyau est arrondi ou ovalaire, plus souvent réniforme ou franchement irrégulier, la chromatine est peu dense (pas de gros blocs chromatiniens) et de structure régulière.
Le cytoplasme est étendu, gris bleuté, avec de fines granulations rosées assez nombreuses qui se fondent souvent avec le fond cytoplasmique.
Il n'est pas rare d'observer des vacuoles intracytoplasmiques.
Ce sont les monocytes qui posent le plus de problèmes d'identification sur les frottis, en raison d'une part de la variabilité de forme et d'aspect que ces cellules présentent et d'autre part, à cause de leur aptitude à se déformer.
Pour les mêmes raisons, c'est dans cette catégorie de cellules que le plus de discordances ont été observées lorsque l'on est passé des formules leucocytaires au microscope aux formules automatisées.
Mais il existe un élément supplémentaire expliquant la sous-estimation du taux des monocytes avec la méthode de décompte classique : c'est la répartition hétérogène des éléments nucléés sur un frottis de sang manuel ; les cellules les plus grandes comme les monocytes ont tendance à se répartir sur les franges ou la queue du frottis et ne sont pas prises en compte lors d'une formule au microscope.
Au cours des monocytoses réactionnelles (0,5 à 1,5.109/1) lors d'un syndrome infectieux ou d'une régénération médullaire, on observe sur les frottis des cellules monocytaires plus jeunes avec un cytoplasme un peu plus basophile et un noyau moins irrégulier.
La durée de séjour des monocytes dans le sang est de 2 jours avant leur passage tissulaire et le temps de transit médullaire de 1 à 2 jours ; il n'y a pas de compartiment de réserve médullaire.
Lymphocytes :
Bien qu'il existe différents types morphologiques de lymphocytes, les tentatives de les séparer en catégories distinctes n'ont pas débouché sur une classification simple.
- Les lymphocytes de petite taille ont un diamètre de 7 à 9 μm ; leur noyau est arrondi ou ovalaire, parfois réniforme ; la chromatine est dense, de couleur violet foncé, composée de masses chromatiniennes sombres plus ou moins nettes ; le cytoplasme est peu étendu, il s'étend le plus souvent d'un seul côté du noyau, il est clair ou légèrement basophile.
- Les lymphocytes de taille plus grande (9 à 15 μm de diamètre) ont un noyau central ou légèrement excentré de couleur violet foncé avec des masses chromatiniennes disposées en blocs compacts entrecoupés de zones claires mais sans démarcations nettes ; le cytoplasme est plus étendu que celui des petits lymphocytes, il entoure complètement le noyau, il est clair, hyalin ou légèrement basophile. Un petit nombre d'entre eux ont des grains intracytoplasmiques (3 à 5 granulations de coloration violacée, de 0,3 à 0,6 μm de diamètre, parfois contenues dans de petites vacuoles).
Cette hétérogénéité morphologique n'est que relative comparée à la diversité des lymphocytes pour ce qui est de leur origine, de leur fonction et de leur durée de vie.
Des tentatives pour corréler l'aspect morphologique au caractère fonctionnel T ou B n'ont pas abouti, hormis pour la catégorie minoritaire des lymphocytes à grains ou « large granular lymphocytes » (LGL) qui correspondent, sur le plan fonctionnel, à deux types de populations : des lymphocytes T cytotoxiques en majorité, et des cellules à activité NK (« natural killer »).
Au cours des hyperlymphocytoses réactionnelles d'origine virale, les modifications morphologiques des lymphocytes peuvent être suffisamment évocatrices pour éliminer une hémopathie maligne.
Il existe alors un excès de lymphocytes de grande taille à cytoplasme basophile associés à quelques cellules lymphoïdes de taille plus grande avec un cytoplasme très basophile ainsi que de rares plasmocytes.
Impératifs techniques :
L'analyse morphologique des éléments figurés du sang reste une étape importante dans l'interprétation de l'hémogramme.
Si, dans la majorité des cas, les appareils automatiques actuels effectuent cette analyse avec plus de rapidité et de reproductibilité que la méthode classique, il reste cependant un petit nombre de situations pathologiques où seule l'observation au microscope permet d'identifier avec certitude les cellules, et ainsi de faire des hypothèses diagnostiques.
Il convient pour cela d'assurer une bonne qualité des frottis et de la coloration. Des problèmes cependant peuvent survenir aux différentes étapes techniques et entraîner des artefacts rendant l'interprétation difficile.
Le frottis ne doit être ni trop épais, car les cellules sont mal étalées, ni trop fin, car les éléments nucléés vont se retrouver dans les franges du frottis.
Il faut parfois adapter l'étalement aux caractéristiques du sang (anémie majeure par exemple ou fragilité excessive des lymphocytes dans les leucémies lymphoïdes chroniques).
Le séchage à l'air des lames après la confection du frottis est suffisant, un séchage plus actif est déconseillé car il surétale les leucocytes et rend la distinction entre les grands lymphocytes et les monocytes difficile.
Les colorants doivent être de bonne qualité, de composition invariable et connue. Ils doivent être fréquemment changés, quotidiennement ou même deux fois par jour, et filtrés pour éviter les dépôts de colorants sur les lames.
Le pH du tampon doit être ajusté à 7, en effet s'il est trop basique les globules rouges prennent une coloration verte et les structures basophiles des leucocytes risquent d'être mal visibles ; si au contraire le pH est trop acide, le cytoplasme des polynucléaires devient rose et les granulations difficiles à voir.
Le sang utilisé pour faire le frottis doit être un sang frais, prélevé le jour même, sinon les leucocytes sont très altérés et non identifiables.
L'observation des lames se fait dans une zone bien particulière du frottis manuel où les éléments sont bien individualisés et non superposés ; il faut éviter la queue du frottis où les éléments, surtout les plus déformables comme les globules rouges et les monocytes, perdent leurs caractéristiques morphologiques.
Enfin, pour la bonne conservation d'un frottis il est nécessaire de luter la lame avec une lamelle à l'aide d'un liquide de montage.
